Thèse Etude d'Un Modèle Murin de Knock-Down du Gène Rfc1 Implication dans la Dégénérescence des Neurones Dopaminergiques H/F - 59

Établissement : Université de Lille
École doctorale : Biologie Santé de Lille
Laboratoire de recherche : Lille Neurosciences & Cognition
Direction de la thèse : Vincent HUIN ORCID 0000000182015406
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-31T23:59:59

Le CANVAS (Cerebellar ataxia with neuropathy and vestibular areflexia syndrome) est une maladie génétique constituant une cause majeure d'ataxie de début tardif. Cette pathologie est causée par des expansions bialléliques situées dans l'intron 2 du gène RFC1 (1). Le gène RFC1 code pour une protéine ubiquitaire, la sous-unité 1 du facteur de réplication C, un complexe protéique impliqué dans la réplication et la réparation de l'ADN des eucaryotes (2). Les mutations du gène RFC1 correspondent à des expansions pentaplets répétées plus de 250 fois chez les patients, avec une modification du motif expansé. Le motif (AAAAG)11 est remplacé par un motif pathogène (AAGGG)n (3). D'autres motifs pathogènes (4,5) et non pathogènes (6) ont été signalés à ce locus. Le phénotype des patients comprend une ganglionopathie presque constante avec ataxie proprioceptive, une dysautonomie, une atteinte cérébelleuse, une atteinte vestibulaire, une atteinte des motoneurones, des douleurs neuropathiques, des troubles cognitifs et une toux chronique (3,7-12). Notre équipe a aussi rapporté un parkinsonisme chez 10 % des patients atteints de CANVAS (11), un taux 10 fois supérieur à celui attendu dans une population saine appariée d'âge similaire (13). Lors d'une précédente étude portant sur plusieurs cohortes de patients atteints de divers syndromes parkinsoniens nous avons aussi confirmé que les expansions bialléliques du gène RFC1 sont une cause rare de syndromes parkinsoniens de transmission mendélienne (14).
Les mécanismes conduisant à la neurodégénérescence dans les troubles liés au gène RFC1 restent mal compris. Comme pour d'autres pathologies génétiques liées à des expansions de régions répétées du génome (15), il est très probable que différents mécanismes moléculaires soient impliqués dans les troubles liés au gène RFC1 (Perte de fonction, gain de fonction toxique des ARN, expression de peptides toxiques répétitifs par le biais d'une traduction non-AUG dépendante). Nous avons choisi d'étudier l'hypothèse de la perte de fonction
Dans ce projet, nous avons choisi de poursuivre l'exploration d'une perte de fonction du gène RFC1 et des mécanismes conduisant à la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques qui conduit au développement d'un syndrome parkinsonien. Pour cela, nous étudions le knock-down du gène RFC1 limité aux neurones dopaminergique de la substance noire. Pour ce faire, nous réaliserons des injections striatales d'un AAV rétrograde (AAVrg) co-exprimant l'eGFP et des shRNA ciblant l'ARNm de Rfc1 (ou des shRNA scrambled) sous le contrôle d'un promoteur tyrosine hydroxylase, sélectif pour les neurones dopaminergiques. Cette stratégie permettra d'éviter la réaction inflammatoire liée à l'injection directe d'AAV dans la SN. Par la suite, nous réaliserons des tests comportementaux et l'analyse histologique des cerveaux des souris afin de mettre en évidence une éventuelle mort neuronale dans la substance noire. Enfin, nous reproduirons ces analyses après induction d'une mort des neurones dopaminergiques par l'injection de MPTP ou de fibrilles préformées d'alpha-synucléine, et afin d'objectiver une plus importante mort neuronale chez les souris avec knock-down de Rfc1.
Nous espérons ainsi démontrer l'effet pathogène de la perte de fonction de RFC1 sur la survenue de syndromes parkinsoniens. Cette étude ouvrira la voie à la création d'autres modèles in vivo des autres syndromes parkinsoniens (Atrophie multisystématisée, démence à cors de Lewy) et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies.

Les syndromes parkinsoniens (SP) sont un groupe de maladies caractérisées cliniquement par l'association d'une bradykinésie, d'une rigidité +/- d'un tremblement de repos. Après exclusions des causes médicamenteuses, vasculaires, infectieuses et traumatiques, de nombreuses maladies neurodégénératives peuvent être responsables d'un SP. Ces maladies neurodégénératives incluent la maladie de Parkinson (MP), la cause la plus fréquente de syndrome parkinsonien et la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente, l'atrophie multisystématisée (AMS) et la démence à cors de Lewy (DCL). Ces trois pathologies sont caractérisées par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine -synucléine dans le cerveau des patients (16) et sont regroupées sous le terme de synucléinopathies.
Des expansions bialléliques du gène RFC1 (Replication factor complex subunit 1) ont récemment été identifiées comme la cause du CANVAS (Cerebellar ataxia with neuropathy and vestibular areflexia syndrome), une maladie génétique constituant une cause majeure d'ataxie (1). Les patients présentent une ataxie, une neuronopathie, des troubles cognitifs et une dysautonomie. Plusieurs études ont aussi rapporté des expansions bialléliques chez des patients répondant aux critères diagnostiques d'AMS (7,17) ou de MP (18). Dans une récente étude, nous avons rapporté un syndrome parkinsonien chez 10 % des patients CANVAS et une accumulation d'-synucléine dans le cerveau d'un patient (11). Cette étude préliminaire sur une cohorte de patients CANVAS nous a permis d'estimer que ces patients ont un risque relatif de développer un SP 10 fois plus élevé que dans la population générale d'âge similaire (13).
Bien que la cause génétique ait été identifiée, les mécanismes moléculaires conduisant à la neurodégénérescence dans les maladies liées à RFC1 restent flous. Les hypothèses concurrentes incluent la traduction non-ATG associée à la répétition, le gain de fonction toxique provenant de l'ARNm portant des expansions répétées et la perte de fonction du RFC1. Des études récentes fournissent des preuves contradictoires. Certaines soutiennent la toxicité de l'ARN indépendante de la RFC1 (19), tandis que d'autres font état d'une létalité embryonnaire précoce et de phénotypes neurologiques graves après l'inactivation de Rfc1 chez le poisson-zèbre (20). Des données génétiques humaines supplémentaires, notamment celles concernant des patients présentant des mutations hétérozygotes composites consistant en une expansion répétitive sur un allèle et une mutation non-sens, un décalage de cadre de lecture, une mutation d'épissage ou une grande délétion exonique sur le deuxième allèle, soutiennent fortement un mécanisme de perte de fonction (21-24). Ces patients présentaient également un phénotype CANVAS associé à une diminution du niveau d'ARNm de RFC1 dans le sang périphérique total (21,22) ou les fibroblastes (22). Enfin, une étude récente a rapporté une perte de fonction du gène RFC4 codant pour un autre membre du complexe protéique « facteur de réplication C » chez des patients atteints d'un trouble multisystémique et présentant un chevauchement clinique avec le CANVAS (25). Nous avons aussi fourni des données préliminaires solides qui renforcent encore cette hypothèse avec l'inhibition du gène Rfc1 par des shRNAS et vecteur viral AAV chez la souris. Lors d'une précédente étude portant sur plusieurs cohortes de patients atteints de divers syndromes parkinsoniens nous avons aussi confirmé que les expansions bialléliques du gène RFC1 sont une cause rare de syndromes parkinsoniens de transmission mendélienne et d'expressivité très variable (14).

Nos objectifs sont de démonter le lien entre les mutations du gène RFC1 et l'apparition d'un SP.

WP1. Mise en évidence d'un lien de causalité entre RFC1 et MP in cellulo.
Sur des modèles de lignées issues de neurones dopaminergiques humains (LHUMES) et de neuroblastome murin (N1-E115), nous testerons l'effet sur la viabilité (coloration à l'iodure de propidium) d'un knockdown de RFC1 à l'aide de shRNAs seul et avec l'ajout de différentes molécules favorisant la mort cellulaire et utilisés dans différents modèles de MP (MPP+, Roténone, Erastine, fibrilles d'-synucléine). En plus de mettre en évidence une mort cellulaire liée à une diminution de l'expression de RFC1, ces expériences pourraient orienter sur la voir métabolique impliquée (anomalie de la mitochondrie, stress oxydant, ferroptose) et surtout valider sur cellules murine l'efficacité des shRNAs.
WP2. Mise en évidence d'un lien de causalité entre RFC1 et MP in vivo.
Afin de mettre en évidence un lien direct entre synucléinopathie et perte de fonction de RFC1, nous testerons dans un modèle de souris C57Black6 l'effet de l'injection dans le striatum (pour transduction rétrograde dans la substance noire) d'un vecteur adénovirus (rAAV) exprimant des shRNAs ciblant Rfc1 et un gène rapporteur exprimant l'eGFP, sous le contrôle d'un promoteur tyrosine hydroxylase, sélectif pour les neurones dopaminergiques. Cette stratégie permettra d'éviter la réaction inflammatoire liée à l'injection directe d'AAV dans la substance noire. Par la suite, nous réaliserons des tests comportementaux et l'analyse histologique des cerveaux des souris afin de mettre en évidence une éventuelle mort neuronale dans la substance noire. Nous rechercherons ensuite chez ces souris des phénotypes moteurs et cognitifs de MP (open field, himb-limb clasping, inverted grid test, rotarod, challenging beam, pole test, Y-maze, Novel object recognition test, Plus maze). Nous testerons si ces souris injectées présentent des lésions neuropathologiques (agrégats d'-synucléine et phosphorylation d'-synucléine par immunohistochimie) et/ou une mort neuronale accrue dans la substance noire. Enfin, nous reproduirons ces analyses après induction d'une mort des neurones dopaminergiques par l'injection de MPTP ou de fibrilles préformées d'alpha-synucléine, et afin de stimuler la perte neuronale dopaminergique et d'objectiver ou non une synergie avec le knock-down de Rfc1, avec une plus importante mort neuronale chez les souris.